C-reaktif protein (CRP), karaciğerde üretilen bir akut faz proteinidir. Sağlıklı genç erişkin kan bağışçılarında medyan düzeyi yaklaşık 0,8 mg/L'dir. Akut faz uyarısından sonra yaklaşık 6 saatte 5 mg/L'yi aşar ve 500 mg/L'nin üzerine çıkabilir.1 Klasik CRP testleri enfeksiyon ve inflamasyonun izlenmesinde kullanılır. Yüksek duyarlıklı (hs-CRP) testler ise kardiyovasküler risk değerlendirmesinde 1 ve 3 mg/L sınırlarına dayanır.6
Bu yazı, CRP immünoassayi geliştiren ya da doğrulayan ekipler içindir. Antijenin yapısını, testin kapsaması gereken ölçüm aralığını, doğal ve rekombinant antijen arasındaki seçimi ve kalibratörün referans malzemeye nasıl bağlandığını ele alır.
Yapı: pentamer ve monomer CRP
CRP, pentraksin ailesinin bir üyesidir. Dolaşımdaki biçimi, beş özdeş ve glikozile olmayan alt birimin kovalent olmayan bağlarla bir halka oluşturduğu pentamerdir. Her alt birim 206 aminoasitten oluşur ve yaklaşık 23 kDa ağırlığındadır.1 Alt birimlerin her biri kalsiyuma bağımlı olarak fosfokoline bağlanır.2 Kalsiyum yokluğunda pentamer kısmen alt birimlerine ayrışabilir.3
Pentamer ayrıştığında monomer CRP (mCRP) oluşur. mCRP'nin çözünürlüğü düşüktür ve doğal pentamerde gizli kalan yeni epitoplar açığa çıkar.4 Klinik olarak ölçülen madde ise pentamerdir.5 Bu yüzden kalibratör ve kontrol materyalinde kullanılan antijenin de pentamer hâlde olması, antikorların hasta numunesindekiyle aynı yapıyı tanıması açısından önemlidir.
- Antijenin oligomer hâli boyut dışlama kromatografisi ve yarı doğal jel elektroforeziyle gösterilebilir. Sertifikalı referans malzemesinde monomer bulunmadığı bu yöntemlerle doğrulanmıştır.7
- Antikor çiftinin pentamer ve mCRP'ye verdiği yanıt ayrı ayrı ölçülürse, testin hangi biçimi gördüğü netleşir.
Ölçüm aralığı ve hs-CRP
Bir CRP testi çok geniş bir aralığı kapsamak zorundadır. Kardiyovasküler risk değerlendirmesinde hs-CRP sonucu 1 mg/L'nin altı düşük, 1–3 mg/L orta, 3 mg/L'nin üstü yüksek risk olarak sınıflandırılır. Bu sınırlar erişkin popülasyonun yaklaşık üçte birlik dilimlerine karşılık gelir. 10 mg/L ve üstündeki bir sonuç risk değerlendirmesinde kullanılmaz; ölçüm iki hafta sonra tekrarlanır.6 Akut inflamasyonda ise değerler 500 mg/L'yi aşabilir.1
Bu iki uç, test tasarımında farklı sorunlar doğurur. Düşük uçta, kalibrasyon eğrisinin doğrusallığı ve ölçüm belirsizliği belirleyicidir. Yüksek uçta ise sandviç formatlarda antijen fazlalığı, sonucun gerçekte olduğundan düşük okunmasına yol açabilir (yüksek doz kanca etkisi).
- Doğrusallık, derişimi ya da derişim oranı bilinen bir numune serisiyle değerlendirilir. Sapmalar, klinik açıdan kabul edilebilirliğine göre yorumlanır.9
- Antijen fazlalığı için, ölçüm aralığının çok üstünde CRP içeren bir numune seyreltilmeden ve seyreltilerek ölçülür.
Doğal ve rekombinant antijen
Doğal CRP, insan kaynaklı biyolojik sıvılardan saflaştırılır. Bu yaklaşımda yapı dolaşımdaki proteinle aynıdır. Ancak kaynak materyal partiden partiye değişir ve insan kaynaklı her materyal için enfeksiyon taraması gerekir.
Rekombinant CRP, tanımlı bir diziden ve tekrarlanabilir bir süreçle üretilir. İnsan kaynaklı materyal gerektirmez. İnsan CRP'si glikozile edilmediği için bakteriyel ekspresyon sisteminde üretilen protein, şeker zincirleri açısından dolaşımdaki proteinden ayrılmaz.1 Rekombinant antijende doğrulanması gereken nokta, alt birimlerin doğru katlanması ve pentamerin oluşmasıdır.
AriVerity'nin CRP antijeni E. coli'de üretilir. Saflık, endotoksin ve immünoreaktivite değerleri her parti için analiz sertifikasında verilir.
İzlenebilirlik: WHO 85/506'dan ERM-DA474'e
CRP için ilk uluslararası standart, Dünya Sağlık Örgütü'nün 85/506 kodlu referans preparatıdır. Bugün yaygın kullanılan sertifikalı referans malzemesi ise insan serumunda CRP içeren ERM-DA474/IFCC'dir. Bu malzemenin CRP değeri, ERM-DA470'ten (eski adıyla CRM 470) değer aktarımıyla atanmıştır. ERM-DA470'in değeri de WHO 85/506 ile kalibre edilen ölçümlere dayanır.7 Laboratuvar tıbbında izlenebilirlik komitesi JCTLM'nin 2023 çalıştayı da ERM-DA474/IFCC'yi komütabl bir ikincil referans malzemesi olarak ele alır.5
Bir kit kalibratörünün değeri bu zincire, üreticinin ana kalibratörü üzerinden bağlanır. ISO 17511, kalibratörlere atanan değerlerin bu zincire nasıl bağlanacağını tanımlar.8 Zincirin anlamlı olması için referans malzemenin komütabl olması gerekir: Testte hasta numunesiyle aynı şekilde davranmalıdır. ERM-DA474/IFCC'nin sertifika raporu, malzeme bir testte kalibratör olarak kullanılacaksa komütabilitenin o test için ayrıca doğrulanmasını ister.7
Kalibratör hazırlama notları
Rekombinant antijen kalibratörde kullanılacaksa, antijenin kendisi kadar içinde bulunduğu matriks de sonucu etkiler. Seçilen matriksin hasta numunesine yakın davranması ve antikor bağlanmasını değiştirmemesi beklenir.
- Değer atama: Kalibratör seviyeleri, sertifikalı referans malzemeye izlenebilir bir ölçüm prosedürüyle atanır.8
- Seviyeler: hs-CRP için düşük uçta, 1 ve 3 mg/L sınırlarının çevresinde yeterli sayıda seviye bulunmalıdır.
- Kararlılık: Kararlılık, açılmamış ve açılmış (kullanımdaki) kalibratör için ayrı ayrı değerlendirilir.10
- Tampon: Antijenin geldiği tamponun bileşimi, matriks seçilirken göz önünde tutulur. Kalsiyumun pentamerin bütünlüğüne etkisi bu noktada önemlidir.3 Ürünün tampon bilgisi teknik veri sayfasında yer alır.
Rekombinant CRP antijeni
Teknik özellikleri, belgeleri ve uygulama alanlarını ürün sayfasında bulabilirsiniz. Kendi testinizde denemek için numune isteyin.
Kaynaklar
- Pepys MB, Hirschfield GM. C-reactive protein: a critical update. J Clin Invest. 2003;111(12):1805–1812. doi:10.1172/JCI18921
- Thompson D, Pepys MB, Wood SP. The physiological structure of human C-reactive protein and its complex with phosphocholine. Structure. 1999;7(2):169–177. doi:10.1016/S0969-2126(99)80023-9
- Okemefuna AI, Stach L, Rana S, et al. C-reactive protein exists in an NaCl concentration-dependent pentamer-decamer equilibrium in physiological buffer. J Biol Chem. 2010;285(2):1041–1052. doi:10.1074/jbc.M109.044495
- McFadyen JD, Kiefer J, Braig D, et al. Dissociation of C-reactive protein localizes and amplifies inflammation: evidence for a direct biological role of C-reactive protein and its conformational changes. Front Immunol. 2018;9:1351. doi:10.3389/fimmu.2018.01351
- Miller WG, Panteghini M, Wielgosz R. Implementing metrological traceability of C-reactive protein measurements: consensus summary from the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine Workshop. Clin Chem Lab Med. 2023;61(9):1558–1560. doi:10.1515/cclm-2023-0498
- Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW, et al. Markers of inflammation and cardiovascular disease: application to clinical and public health practice. Circulation. 2003;107(3):499–511. doi:10.1161/01.CIR.0000052939.59093.45
- Auclair G, Zegers I, Charoud-Got J, et al. The certification of the mass concentration of C-reactive protein in human serum: certified reference material ERM-DA474/IFCC. Certification report EUR 24922 EN. Luxembourg: Publications Office of the European Union; 2011. doi:10.2787/4947
- ISO 17511:2020. In vitro diagnostic medical devices: Requirements for establishing metrological traceability of values assigned to calibrators, trueness control materials and human samples. 2nd ed. Geneva: ISO; 2020.
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of Linearity of Quantitative Measurement Procedures. 2nd ed. CLSI guideline EP06. Wayne, PA: CLSI; 2020.
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of Stability of In Vitro Medical Laboratory Test Reagents. 2nd ed. CLSI guideline EP25. Wayne, PA: CLSI; 2023.
