NT-proBNP, öncül protein proBNP'nin bölünmesiyle oluşan 76 aminoasitlik parçadır. Öteki parça hormon olan BNP'dir (BNP 1-32).1 Kalp yetmezliğinin tanısında kullanılır. Avrupa kılavuzuna göre akut olmayan ortamda NT-proBNP için normalin üst sınırı 125 pg/mL'dir.2 Akut ortamda 300 pg/mL'nin altındaki bir değer kalp yetmezliğini büyük olasılıkla dışlar. Tanıyı destekleyen sınırlar ise yaşa göre 450, 900 ve 1800 pg/mL'dir.3
Bu yazı, NT-proBNP immünoassayi geliştiren ya da doğrulayan ekipler içindir. Molekülün glikozilasyonunu, bunun epitop seçimine etkisini, glikozile olmayan rekombinant kalibratörün neyi temsil ettiğini ve testler arası uyumu ele alır.
proBNP, BNP ve NT-proBNP
proBNP salgılanırken büyük ölçüde iki parçaya bölünür: BNP 1-32 ve NT-proBNP 1-76.1 Bölünmede furin ve korin aday enzimlerdir. Hücre modelinde furin BNP 1-32'yi, korin ise BNP 4-32'yi oluşturmuştur.4 Bölünme noktasına yakın bir şeker zinciri proBNP'nin bölünmesini baskılayabilir.5
NT-proBNP kandan birden fazla doku tarafından temizlenir.6 Böbrek bu yollardan biridir ama tek yol değildir.
Glikozilasyon ve epitop seçimi
proBNP bir O-glikoproteindir. Memeli hücresinde üretilen rekombinant proBNP'de yedi O-glikozilasyon bölgesi bulunmuştur. Bölgelerin hepsi molekülün orta kısmında, 36 aminoasitlik bir dizide toplanır; BNP kısmında şeker zinciri yoktur.7
Kanda dolaşan NT-proBNP'nin de orta bölümü glikozilledir. Bu bölgeyi tanıyan antikorlar glikozile molekülü zayıf tanır. Çiftteki antikorlardan yalnız biri bile bu bölgeye bağlanıyorsa test, kandaki NT-proBNP'yi olduğundan düşük ölçebilir. N-uca (13-24) ve C-uca (63-76) yakın epitopları tanıyan antikorlar ise glikozile ve glikozu uzaklaştırılmış proteini benzer verimle tanır.8
C-uçtaki bu bölge yalnız NT-proBNP'de serbesttir. Bölünmemiş proBNP'de aynı bölge şeker zincirleri nedeniyle antikorlara kapalı kalır.5
Şeker zincirlerinin ne kadar sinyal sakladığı da ölçülmüştür. Akut nefes darlığıyla başvuran kalp yetmezliği hastalarında numuneler glikozidazla işlendikten sonra medyan NT-proBNP 3588'den 7497 ng/L'ye çıkmıştır. Tanısal doğruluk üzerindeki etki ise küçük kalmıştır: Eğri altındaki alan 0,852'den 0,871'e yükselmiştir.9 Glikozsuz bölgeleri hedefleyen antikorlarla kurulan bir testin tanısal değeri de mevcut testlere yakın bulunmuştur.10
Rekombinant ve glikozile kalibratör
E. coli'de üretilen NT-proBNP glikozile değildir. Bu yüzden kanda dolaşan molekülün glikozile kısmını değil, şeker taşımayan biçimini temsil eder. Başlıktaki sorunun kısa cevabı budur.
Bunun pratikteki sonucu antikor çiftine bağlıdır. İki antikor da şekerden etkilenmeyen bölgelere bağlanıyorsa test, glikozile olmayan kalibratörü ve hastadaki glikozile molekülü benzer biçimde görür.8 Antikorlardan biri orta bölgeye bağlanıyorsa kalibratör tam tanınır, hastadaki molekülün ise bir kısmı görünmez kalır. Bugünkü NT-proBNP testlerinin NT-proBNP ve proBNP'nin glikozile biçimlerini saptamadığı gösterilmiştir.11
Kalibrasyonda hangi tür standardın kullanılması gerektiği konusunda henüz uzlaşma yoktur.12 BNP testlerinde memeli hücresinde üretilmiş glikozile proBNP ortak kalibratör olarak kullanıldığında testler arası uyum iyileşmiştir.13 Bu bulgu BNP içindir ve NT-proBNP'ye doğrudan genellenemez.
Glikozile olmayan saf peptidin güçlü yanı, tanımlı ve miktarı kesin olarak belirlenebilen bir malzeme olmasıdır. NT-proBNP için geliştirilen SI izlenebilir aday sertifikalı referans malzemesi de saf peptit üzerine kurulmuş, izotop seyreltmeli kütle spektrometrisi ve aminoasit analiziyle karakterize edilmiştir.14
AriVerity'nin NT-proBNP antijeni E. coli'de üretilir ve glikozile değildir. Saflık ve immünoreaktivite değerleri her parti için analiz sertifikasında verilir.
Testler arası uyumsuzluk
BNP ya da NT-proBNP sonuçları bugünkü immünoassayler arasında birbirine aktarılamaz.11 İsveç'te 2011–2021 dış kalite programı verilerinde NT-proBNP için laboratuvarlar arası toplam varyasyon katsayısı %4 ile %27 arasında bulunmuştur. 2019–2021 arasında bir üreticinin sonuçları konsensüs medyanının %16–20 üzerinde kalmış, yeni yöntemler piyasaya girdikten sonra uyum azalmıştır.15
Klinik karar sınırları büyük ölçüde belirli yöntemlerle elde edilmiş verilere dayanır.15 Bu yüzden yeni bir test, kalibratörü ne olursa olsun, bu sınırların çevresindeki hasta numuneleriyle karşılaştırılarak doğrulanmalıdır.
Referans ölçüm çalışmaları
NT-proBNP için SI birimlerine izlenebilir bir sertifikalı referans malzemesi ya da referans ölçüm prosedürü henüz yoktur.14 Standardizasyonun önündeki güçlük, kanda dolaşan BNP ile ilgili peptitlerin çeşitliliğidir: bölünmüş ve bölünmemiş biçimler, farklı oranlarda glikozile moleküller.12 Kütle spektrometrisiyle karakterize edilen aday referans malzemesi bu boşluğa yönelik ilk adımlardandır.14
Doğrulama kontrol listesi
- Antikor çiftinin epitopları haritalanır. Epitopların glikozile orta bölgeye girip girmediği belgelenir.78
- Aynı hasta numuneleri glikozidazla işlenmeden önce ve işlendikten sonra ölçülür. Aradaki fark, testin glikozile moleküle duyarlılığını gösterir.9
- BNP, proBNP ve bunların glikozile biçimleriyle çapraz tepkime sınanır ve bildirilir.16
- Yöntem karşılaştırması 125 ve 300 pg/mL sınırlarının çevresindeki hasta numuneleriyle yapılır; dış kalite programına katılınır.315
- Kalibratörün değer ataması (aminoasit analizi, kütle spektrometrisi) belgelenir.14
Rekombinant NT-proBNP antijeni
Teknik özellikleri, belgeleri ve uygulama alanlarını ürün sayfasında bulabilirsiniz. Kendi testinizde denemek için numune isteyin.
Kaynaklar
- Mair J. Biochemistry of B-type natriuretic peptide: where are we now? Clin Chem Lab Med. 2008;46(11):1507–1514. doi:10.1515/CCLM.2008.295
- McDonagh TA, Metra M, Adamo M, et al. 2021 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure. Eur Heart J. 2021;42(36):3599–3726. doi:10.1093/eurheartj/ehab368
- Mueller C, McDonald K, de Boer RA, et al. Heart Failure Association of the European Society of Cardiology practical guidance on the use of natriuretic peptide concentrations. Eur J Heart Fail. 2019;21(6):715–731. doi:10.1002/ejhf.1494
- Semenov AG, Tamm NN, Seferian KR, et al. Processing of pro-B-type natriuretic peptide: furin and corin as candidate convertases. Clin Chem. 2010;56(7):1166–1176. doi:10.1373/clinchem.2010.143883
- Semenov AG, Postnikov AB, Tamm NN, et al. Processing of pro-brain natriuretic peptide is suppressed by O-glycosylation in the region close to the cleavage site. Clin Chem. 2009;55(3):489–498. doi:10.1373/clinchem.2008.113373
- Palmer SC, Yandle TG, Nicholls MG, et al. Regional clearance of amino-terminal pro-brain natriuretic peptide from human plasma. Eur J Heart Fail. 2009;11(9):832–839. doi:10.1093/eurjhf/hfp099
- Schellenberger U, O'Rear J, Guzzetta A, et al. The precursor to B-type natriuretic peptide is an O-linked glycoprotein. Arch Biochem Biophys. 2006;451(2):160–166. doi:10.1016/j.abb.2006.03.028
- Seferian KR, Tamm NN, Semenov AG, et al. Immunodetection of glycosylated NT-proBNP circulating in human blood. Clin Chem. 2008;54(5):866–873. doi:10.1373/clinchem.2007.100040
- Røsjø H, Dahl MB, Jørgensen M, et al. Influence of glycosylation on diagnostic and prognostic accuracy of N-terminal pro-B-type natriuretic peptide in acute dyspnea: data from the Akershus Cardiac Examination 2 Study. Clin Chem. 2015;61(8):1087–1097. doi:10.1373/clinchem.2015.239673
- Li L, Semenov AG, Feygina EE, et al. Diagnostic utility of total NT-proBNP testing by immunoassay based on antibodies targeting glycosylation-free regions of NT-proBNP. Clin Chem Lab Med. 2023;61(3):485–493. doi:10.1515/cclm-2022-1194
- Saenger AK, Rodriguez-Fraga O, Ler R, et al. Specificity of B-type natriuretic peptide assays: cross-reactivity with different BNP, NT-proBNP, and proBNP peptides. Clin Chem. 2017;63(1):351–358. doi:10.1373/clinchem.2016.263749
- Semenov AG, Feygina EE. Standardization of BNP and NT-proBNP immunoassays in light of the diverse and complex nature of circulating BNP-related peptides. Adv Clin Chem. 2018;85:1–30. doi:10.1016/bs.acc.2018.02.001
- Semenov AG, Tamm NN, Apple FS, et al. Searching for a BNP standard: glycosylated proBNP as a common calibrator enables improved comparability of commercial BNP immunoassays. Clin Biochem. 2017;50(4–5):181–185. doi:10.1016/j.clinbiochem.2016.11.003
- Xiao P, Chen J, Wu P, et al. Development of an SI-traceable N-terminal pro-B-type natriuretic peptide certified reference material using structure-based impurity-corrected isotope dilution mass spectrometry approaches. Anal Bioanal Chem. 2024;416(14):3447–3458. doi:10.1007/s00216-024-05295-9
- Lundgren M, Ridefelt P, Karlsson M, et al. Interlaboratory variation for NT-proBNP among Swedish laboratories in an external quality program 2011–2021. Clin Chem Lab Med. 2023;61(9):1643–1651. doi:10.1515/cclm-2023-0051
- Clerico A, Franzini M, Masotti S, et al. State of the art of immunoassay methods for B-type natriuretic peptides: an update. Crit Rev Clin Lab Sci. 2015;52(2):56–69. doi:10.3109/10408363.2014.987720
